DEVELOPMENTAL CHANGES OF GLYCOSAMINOGLYCANS IN THE HUMAN FETAL BLADDER WALL

LUIZ E.M. CARDOSO, CRISTIANA LINS, FRANCISCO J.B. SAMPAIO, WALDEMAR SILVA COSTA

Unidade de Pesquisa Urogenital, Centro Biomédico, UERJ, Rio de Janeiro, RJ

ABSTRACT

     Objectives: Glycosaminoglycans (GAGs) play key roles in the normal physiology and pathology of the bladder. There is little data, however, on GAG composition in the human fetal bladder wall. In the present study we aimed at establishing the composition of GAGs in the bladder wall of human fetuses at different gestational ages.
     Methods: Bladder samples consisting of the dome and front wall were obtained from 4 fresh, macroscopically normal human fetuses aged 13 to 32 weeks postconception (WPC). GAGs in delipidated tissue samples were extracted by papain digestion and cetylpyridinium chloride/ethanol precipitation. The concentration of total GAG was assessed by a hexuronic acid assay and expressed as mg hexuronic acid per mg dry tissue, while the proportions of sulfated GAG species were determined by agarose gel electrophoresis.
     Results: At 13 WPC bladder GAG concentration is about 2.2 mg/mg. It then decreases slowly, and at 32 WPC the value is 1.8 mg/mg. Proportions of sulfated GAGs from 13 to 21 WPC are stable, with 40% chondroitin sulfate, 50% dermatan sulfate, and 10% heparan sulfate. At 32 WPC, however, the proportions of chondroitin and dermatan sulfate are 48 and 42%, respectively.
     Conclusion: Overall, the extracellular matrix of the vesical wall does not undergo dramatic compositional changes between the 13th and 32nd WPC. Still, the lower GAG concentration and the change in the proportions of GAG species at the 32nd WPC suggest that major developmental modifications in the vesical wall, which certainly bear on the mechanical properties of the bladder, occur by this period.

Key words: bladder, fetus, glycosaminoglicans, development
Braz J Urol, 26: 97-101, 2000

INTRODUÇÃO

     Glicosaminoglicanos (GAGs) são heteropolissacarídeos complexos que possuem quantidades diversas de grupamentos carboxila e sulfato. Os GAGs portanto têm alta densidade de grupamentos aniônicos, e in vivo esses polissacarídeos existem sob a forma de glicoconjugados denominados proteoglicanos, cuja parte protéica contem quantidades variáveis de domínios de adesão. Os proteoglicanos têm, dessa forma, grande capacidade de interações específicas com o meio circundante, e suas funções fisiológicas são basicamente decorrentes dessa propriedade. Essas funções incluem principalmente: (1) retenção seletiva de íons e moléculas difusíveis; (2) organização estrutural da matriz extracelular; (3) regulação da interação célula-matriz extracelular e célula-célula; (4) modulação do efeito de citocinas; e (5) regulação da atividade de proteases (1-3).
     Os GAGs desempenham diferentes e importantes funções na fisiologia da bexiga. Em virtude de sua bem conhecida interação com o colágeno e outros componentes da matriz extracelular (4), pode-se inferir que os GAGs têm participação marcante nas propriedades de complacência da parede vesical, embora tal fato não tenha sido ainda apropriadamente investigado. Uma função que vem sendo bem estudada, e que tem implicações clínicas imediatas, é participação dos GAGs na permeabilidade do urotélio. Resultados de diversos trabalhos, utilizando tanto métodos morfológicos como bioquímicos, têm mostrado que a camada de glicocálix sobre o urotélio é enriquecida em GAGs (5,6). Outros experimentos revelaram que essa camada não apenas impede a difusão de componentes da urina para dentro da parede da bexiga (7), mas também dificulta a aderência de bactérias ao urotélio (8,9). Baseados nessas propriedades, tem-se correlacionado alterações de GAG do urotélio com a cistite intersticial (10,11). É importante notar que essas alterações limitam-se, provavelmente, à composição de GAGs, pois não foram detectadas diferenças morfológicas em relação ao tecido normal (6).
     Existem poucos trabalhos sobre a composição de proteoglicanos e GAGs na bexiga de humanos, e estes utilizam apenas tecido de adultos (12,13). Embora alguns estudos tenham sido feitos sobre as alterações com o desenvolvimento do colágeno em humanos (14) e em animais (15,16), dados semelhantes sobre proteoglicanos e GAGs, os quais forneceriam informações funcionais importantes sobre esses componentes, são inexistentes. Essa questão foi abordada no presente trabalho, no qual se investigou a concentração e composição bioquímica de GAGs em bexigas provenientes de fetos humanos de diferentes idades gestacionais.

MATERIAL E MÉTODOS

     As amostras consistiram da bexiga de 4 fetos masculinos com idade gestacional variando entre 13 e 32 semanas pós-concepção (SPC), segundo o método de medida do pé mais longo (17). Os fetos estavam macroscopicamente bem preservados e não apresentavam sinais externos de malformações congênitas. Após dissecção, a cúpula e a parede anterior da bexiga foram removidas e imediatamente fixadas em acetona. As amostras foram então delipidadas por meio de duas trocas de 24 horas cada em clorofórmio:metanol (2:1, v/v), e depois secas a 60C. A parede vesical foi analisada por inteiro, sem se fazer distinção entre urotélio, lâmina própria, e camada muscular.
     A extração de GAGs seguiu um protocolo previamente descrito (18). Resumidamente, cerca de 30 a 100mg de tecido delipidado e seco foram incubadas com papaína bicristalizada (Sigma) em tampão acetato 100mM, pH 5,0, contendo cisteína 5mM e EDTA 5 mM, por 24 horas a 60C. Após centrifugação, cloreto de cetilpiridinio (CPC) foi adicionado ao sobrenadante para precipitar os GAGs. As amostras foram centrifugadas e o complexo CPC-GAG no pellet foi dissociado com NaCl 2M. Os GAGs foram por fim precipitados ao se adicionar 2 volumes de etanol absoluto às amostras, que foram então mantidas a 4C por 24 horas. Após uma série de centrifugações e lavagens do pellet, obteve-se a preparação final de GAGs totais, a qual foi utilizada nas análises subsequentes.
     A quantificação de GAGs totais foi feita por meio da dosagem de ácido hexurônico, utilizando o método do carbazol (19), no qual as amostras purificadas de GAG são primeiramente tratadas com H2SO4 a 100C. A concentração de GAG no tecido vesical foi expressa em microgramas de ácido hexurônico por miligrama de tecido delipidado e seco.
     A quantidade relativa dos GAGs sulfatados (condroitim sulfato, dermatan sulfato, e heparan sulfato) foi determinada por eletroforese em gel de agarose a 0,5% em tampão 1,3-diaminopropano 50 mM, pH 9,0 (20). Após corrida a 80V, o gel foi fixado em brometo de N-Cetil-N,N,N-trimetilamônio 0.1%, corado em azul de toluidina 0,1%, e a proporção dos GAGs foi determinada por densitometria das bandas seguida de integração dos picos usando o programa Scion Image (Scion Corp, Maryland, USA). A identificação das bandas na placa de agarose foi feita com base na comparação com a migração de padrões de GAG comerciais (Sigma) e na susceptibilidade à degradação por GAG-liases (18).

RESULTADOS

     As amostras de bexiga fetal estudadas indicam que a concentração de GAG total nesse tecido diminui ligeiramente entre a 13a e a 32a SPC (Figura-1). Nesse período, a concentração de GAG, expressa como microgramas de ácido hexurônico por miligrama de tecido delipidado e seco, passa de 2.2 a 1.8 em valores médios.



     Os GAGs sulfatados majoritários na parede da bexiga fetal, como mostrado pela eletroforese em gel de agarose, são o dermatan sulfato e o condroitin sulfato, havendo, além disso, em torno de 10% de heparan sulfato (Figura-2). O conteúdo relativo desse último GAG sofre poucas alterações entre a 13a e a 32a SPC. De maneira similar, as proporções dos outros GAGs se mantêm estáveis nas amostras de 13 e 21 SPC, nas quais se observa uma predominância do dermatan sulfato (49-51%) quando comparado ao condroitin sulfato (40-41%). Na amostra de 32 SPC, no entanto, essa relação se inverte, e o conteúdo relativo do condroitin sulfato (48%) passa a ser maior que o do dermatan sulfato (42%).


DISCUSSÃO

     Os resultados obtidos no presente trabalho mostram que, de uma maneira geral, a composição de GAGs na parede vesical não sofre grandes alterações no período estudado, que se situa entre a 13a e a 32a SPC. Nesse mesmo período, estruturas de tecido conjuntivo associadas ao testículo, por exemplo, apresentam modificações muito mais marcantes (observações não publicadas). Por outro lado, nossos resultados indicam que as modificações mais acentuadas na composição de GAGs ocorre mais para o final do período analisado, em torno da 32a SPC. Nessa idade gestacional, a concentração de GAGs é menor do que em idades mais iniciais, e há uma inversão nas proporções do dermatan e condroitin sulfato. Esses 2 GAGs estão associados principalmente aos proteoglicanos decorina/biglican e versican, respectivamente, os quais têm distribuição predominantemente intersticial (3).
     A imunomarcagem de elastina e de colágenos tipo I e III em bexigas normais e não complacentes sugere que a lâmina própria é um componente fundamental para essa propriedade mecânica (21). Como decorina/biglican e versican ocorrem tipicamente na lâmina própria de epitélios, as modificações em concentração e composição de GAGs em fases mais tardias do período fetal, como mostrado por nossos resultados, estão provavelmente relacionadas de maneira estreita com as propriedades de complacência da parede vesical.
     Outros estudos utilizando a mesma técnica de imunohistoquímica revelaram que o sindecan-1, um proteoglicano de heparan sulfato, predomina no urotélio (22). Dessa forma, a ausência de variação na concentração relativa do heparan sulfato, no período fetal estudado, sugere que a camada de GAGs do urotélio está presente desde idades gestacionais iniciais.

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Pesquisa financiada por CNPq e FAPERJ


REFERÊNCIAS

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Received: January 10, 2000
Accepted: February 10, 2000

RESUMO

COMPOSIÇÃO DE GLICOSAMINOGLICANOS DURANTE O DESENVOLVIMENTO DA PAREDE VESICAL EM FETOS HUMANOS

     Objetivos: Os glicosaminoglicanos (GAGs) desempenham papel fundamental na fisiologia normal e patológica da bexiga. Existem poucos dados, entretanto, sobre a composição de GAGs na parede da bexiga fetal de humanos. O presente estudo teve por objetivo estabelecer a composição de GAGs na parede vesical de fetos humanos de diferentes idades gestacionais.
     Métodos: As amostras consistiram da cúpula e parede anterior de bexigas de 4 fetos macroscopicamente normais e com idade entre 13 e 32 semanas pós-concepção (SPC). Os GAGs em amostras delipidadas de tecido foram extraídos por digestão com papaína e precipitação com cloreto de cetilpiridínio/etanol. A concentração de GAG total foi determinada pela dosagem de ácido hexurônico, e foi expressa como mg de ácido hexurônico por mg de tecido seco, enquanto que as proporções de GAGs sulfatados foram determinadas por eletroforese em gel de agarose.
     Resultados: Com 13 SPC a concentração de GAG na bexiga é de 2.2 mg/mg. Esse valor então decresce lentamente, e com 32 SPC é de 1,8 mg/mg. As proporções dos GAGs da 13a à 21a SPC são estáveis, com 40% de condroitin sulfato, 50% de dermatan sulfato, e 10% de heparan sulfato. Com 32 SPC, entretanto, as proporções são 48 e 42%, respectivamente.
     Conclusões: A matriz extracelular da parede vesical não sofre grandes mudanças de composição entre a 13a e a 21a SPC. No entanto, a concentração de GAG mais baixa, e a alteração nas proporções dos GAG na 32a SPC sugerem que modificações importantes na parede vesical com o desenvolvimento, que certamente se relacionam com as propriedades mecânicas da bexiga, ocorrem nesse período.

Unitermos: bexiga, feto, glicosaminoglicanos, matriz extracelular
Braz J Urol, 26: 97-101, 2000


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Unidade de Pesquisa Urogenital
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