EFFECTS OF L-ARGININE AND L-NAME ON RENAL ISCHEMIA - REPERFUSION IN RATS

ERNANI L. RHODEN, CLÁUDIO TELÖKEN, CARLOS A.V. SOUTO, CLÁUDIA R. RHODEN, MÁRCIO L. LUCAS, A. BELLÓ-KLEIN

Divisions of Urology and Pharmacology, Federal Foundation School of Medicine of Porto Alegre (FFFCMPA), and Laboratory of Cardiovascular Physiology, Federal University of Rio Grande do Sul (UFRS), RS, Brazil

ABSTRACT

     Introduction: Nitric oxide (NO) is a very important peripheral and renal vasodilator derived from L-arginine in a reaction modulated by nitric oxide synthase (NOS). We here analyze the role of L-arginine/NO in the renal function and oxidative stress in rats submitted to renal ischemia-reperfusion.
     Material and Methods: For the renal function, we used four groups of animals: control group; ischemia-reperfusion group; a group pretreated with L-NAME (an inhibitor of NOS); and a group pretreated with L-arginine. Serum creatinine was measured in the 24, 96, and 192 hours of reperfusion. In another six groups, we analyzed the oxidative stress through chemioluminescence initiated by tert-butyl hidroperoxide (QL). We used ANOVA, followed by Bonferroni’s t test (p < 0.05) for statistical analysis.
     Results: Renal ischemia-reperfusion significantly increased both renal dysfunction and oxidative stress, when compared with the control groups, in 24 and 96 hours of reperfusion (p < 0.05). L-NAME increased the levels of serum creatinine in 24 and 96 hours (p < 0.05), and also increased the oxygen species activity (p < 0.05) during renal ischemia-reperfusion. Furthermore, L-arginine significantly protected the renal function and also inhibited the increase in chemioluminescence induced by L-NAME (p < 0.05) during 24 and 96 hours of reperfusion.
     Conclusion: Our results suggest that Nitric oxide (NO) has a protective effect against renal ischemia-reperfusion-induced injury in rats.

Key words: kidney; renal ischemia; nitric oxide; free radical; L-NAME; L-arginine
Braz J Urol, 27: 78-83, 2001

INTRODUÇÃO

     No rim, a injúria tecidual decorrente da síndrome isquêmica-reperfusional é uma causa importante de disfunção orgânica em transplante renal, cirurgias de revascularização da artéria renal, nefrectomias parciais, bem como no tratamento cirúrgico de aneurismas da aorta supra-renal (1,2). Os mecanismos propostos para explicar a lesão secundária à isquemia-reperfusão tecidual são diversos: liberação de espécies ativas de oxigênio (EAO) durante a reoxigenação tecidual; acumulação leucocitária; e subseqüente liberação de EAO adicionais e enzimas líticas (1,3). Fisiologicamente, o processo isquêmico, no rim, é caracterizado por diminuição do fluxo sangüíneo renal, decréscimo da filtração glomerular e diminuição do coeficiente de ultrafiltração renal, além de disfunção tubular secundária à obstrução e dano do epitélio tubular (1,3,4).
     O óxido nítrico (NO), conhecido como fator relaxante derivado do endotélio (FRDE), é um substrato do aminoácido L-arginina resultante da ação enzimática da óxido nítrico sintase (NOS). Revisões recentes têm demonstrado que o NO, além de ser um importante vasodilatador endógeno, parece exercer papéis relevantes dentro do contexto fisiopatológico do organismo humano (5-7). Além disso, supõe-se que o NO tenha papel ambíguo durante a isquemia-reperfusão tecidual: na isquemia, ele parece proteger o tecido devido sua propriedade vasodilatadora e ação contra o acúmulo leucocitário; contudo, durante a reoxigenação do tecido isquêmico, o NO pode reagir com moléculas de superóxido (O2-) e formar o radical peroxinitrito (ONOO-), um importante agente causador da lipoperoxidação de membranas celulares (6).
     O objetivo de nosso estudo é verificar o comportamento da função renal de ratos pré-tratados com L-arginina (precursor do NO) ou com L-NAME (NG-nitro-L-arginina-metil-éster - um inibidor da NOS) e submetidos à isquemia-reperfusão renal. Além disso, deseja-se estudar a participação do NO sobre a atividade das EAO na mesma situação. Com isso, pretende-se avaliar, indiretamente, a importância da via L-arginina/NO durante o evento isquêmico-reperfusional no rim.

MATERIAL E MÉTODOS

     Foram utilizados 97 ratos Wistar, adultos, pesando entre 250 e 330 g, criados no Biotério da Disciplina de Farmacologia de nossa Faculdade. Durante o experimento, os animais foram mantidos em condições controladas de luz (ciclo claro das 7 às 19 horas) e temperatura (22 ± 2oC), recebendo água potável e ração padronizada ad libitum. Todos os experimentos foram aprovados por um Comitê Institucional de Uso e Cuidado de Animais em Experimentação.
     Para o estudo da participação do NO sobre a função renal, no evento isquêmico-reperfusional, 39 animais foram divididos, aleatoriamente, em quatro grupos. Grupo C (controle/n = 10): ratos em que se dissecou o pedículo renal esquerdo, expondo-o por um período de 50 minutos (operação simulada). Grupo I-R (n = 10): grupo submetido à dissecção e clampeamento (com pinças vasculares atraumáticas) do pedículo renal esquerdo (com exceção do ureter) por um período de 50 minutos, seguida de reperfusão tecidual. Grupo L-NAME + I-R (n = 10): animais pré-tratados com L-NAME (Sigma, Brasil) (20 mg/kg; via intraperitoneal) 20 minutos antes da cirurgia de clampeamento da artéria e veia renais esquerdas, por um tempo de 50 minutos, com reoxigenação, logo a seguir, do rim isquêmico. Grupo L-arg + I-R (n = 10): grupo pré-tratado com L-arginina (Sigma, Brasil), na dose de 200 mg/kg (via i.p.), 20 minutos antes da cirurgia conforme o grupo anterior.
     Todos os animais foram anestesiados com tiopental sódico (Cristália, Brasil) (50 mg/kg; via i.p.). O fechamento da cavidade nos animais, foi feito por planos, utilizando-se fios absorvíveis para o músculo e fios inabsorvíveis para a pele. Logo após as cirurgias, os animais foram acondicionados em gaiolas de plástico (17 x 34 x 18 cm), em número de 3 ou 4 ratos por gaiola, nas condições do biotério conforme citadas anteriormente. Procedeu-se, então, à coleta de amostras de sangue periférico (plexo retro-ocular) para dosagem das creatininas séricas de todos os ratos nos tempos de 24, 96 e 192 horas após o término dos procedimentos correspondentes a cada grupo. Para a coleta de sangue, os ratos foram anestesiados com éter etílico inalatório.
     Para o estudo da interação entre o NO e as EAO durante a isquemia-reperfusão renal, 58 ratos foram divididos, aleatoriamente, em seis grupos. Grupo C (controle/n = 9): ratos em que se dissecou o pedículo renal esquerdo, expondo-o por um período de 50 minutos. Grupo I (isquêmico/n = 9): animais submetidos apenas à isquemia renal esquerda por 50 minutos. Grupo I-R (n = 10): grupo submetido ao clampeamento pedículo renal esquerdo (com exceção do ureter) por um período de 50 minutos, seguida de reperfusão tecidual por 50 minutos. Grupo L-NAME + I-R (n = 10): animais pré-tratados com L-NAME, 20 mg/kg (via i.p.), 20 minutos antes da cirurgia renal. Grupo L-arg + I-R (n = 10): grupo pré-tratado com L-arginina, na dose de 200 mg/kg (via i.p.), 20 minutos antes da cirurgia conforme o grupo anterior. Grupo L-NAME + L-arg + I-R (n = 10): animais submetidos ao pré-tratamento com L-NAME e, em seguida, com L-arginina, 20 minutos antes da cirurgia.
     A indução anestésica foi feita conforme descrição anterior. Após os procedimentos, realizou-se, em seguida, as nefrectomias totais de todos os rins esquerdos dos animais, com o objetivo de utilizarmos o tecido renal para análise da atividade das EAO através do método de quimioluminescência iniciada por hidroperóxido de tert-butil (QL), que mede, em contas por segundo por miligrama de proteína (cps/mg de proteína), a energia luminosa emitida pelo retorno ao estado fundamental de carbonilas excitadas e oxigênio singlet durante o estresse oxidativo nas células renais (8).
     Os níveis de creatinina sérica (em mg/dl) e os valores obtidos pela QL (em cps/mg de proteína), todos representados pela média ± desvio padrão, foram submetidos à análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste t de Bonferroni, sempre considerando-se um intervalo de confiança de 95% (p < 0.05).

RESULTADOS

     Os valores médios de creatinina sérica para cada grupo, nos diferentes tempos de reperfusão renal, estão representados graficamente na Figura. Os resultados demonstraram que a isquemia-reperfusão renal foi responsável por um acréscimo significativo dos níveis de creatinina sérica nas 24 e 96 horas de reperfusão (p < 0.05). Entretanto, os níveis de creatinina do grupo I-R demonstraram-se iguais aos do grupo controle nas 192 horas de reoxigenação tecidual (0.45 ± 0.07 vs. 0.42 ± 0.01 mg/dl; p > 0.05).



     O pré-tratamento com L-NAME não trouxe um aumento significativo na disfunção renal, durante a síndrome isquêmica-reperfusional, nos períodos de 24 e 96 horas de recuperação pós-isquemia (p > 0.05); contudo, os níveis séricos de creatinina, quando comparados as do grupo isquêmico não tratado, mantiveram-se significativamente elevados ao término de 192 horas de reperfusão renal (0.70 ± 0.27 vs. 0.45 ± 0.07 mg/dl; p < 0.05).
     A administração prévia de L-arginina diminuiu, significativamente, os níveis de creatinina sérica após 24 e 96 horas de reperfusão nos animais submetidos à isquemia renal (p < 0.05). No entanto, tal efeito benéfico da L-arginina não foi evidenciado após as 192 horas de reperfusão, visto que, neste momento, os níveis de creatinina demonstraram-se significativamente superiores aos do grupo isquêmico não tratado (0.61 ± 0.08 vs. 0.45 ± 0.07 mg/dl; p < 0.05).
     Quanto à QL, os resultados obtidos estão arrolados na tabela. A isquemia per se não foi capaz de aumentar, significativamente, a atividade das EAO quando em comparação com o grupo controle (6360 ± 715 vs. 3763 ± 633 cps/mg de proteína; p > 0.05). Durante a isquemia-reperfusão renal, a expressão das EAO tornou-se significativamente maior em relação aos grupos isquêmico e controle (p < 0.05). No entanto, a L-arginina diminuiu, significativamente, o grau de lipoperoxidação das membranas renais durante após o procedimento de isquemia-reperfusão (5574 ± 909 vs. 13660 ± 1104 cps/mg de proteína; p < 0.05).
     A administração prévia de L-NAME provocou um aumento significativo do estresse oxidativo das membranas renais, medido através da QL, durante o evento isquêmico-reperfusional (p < 0.05). Contudo, nos animais em que administramos, simultaneamente, L-arginina e L-NAME, observamos um efeito protetor sobre os níveis de QL quando comparado ao grupo tratado apenas com L-NAME (5510 ± 767 vs. 17482 ± 4397 cps/mg de proteína; p < 0.05).

DISCUSSÃO

     Sintetizando nossos achados, podemos verificar que a síndrome de isquemia e reperfusão renal causou um decréscimo importante da função renal e aumentou significativamente a atividade das EAO quando em comparação aos grupos controles. Além disso, houve um acréscimo significativo nos níveis de QL através da inibição da síntese de NO após a cirurgia (p < 0.05). Notou-se, ainda, que a administração prévia de L-arginina foi capaz de proteger a função renal e amenizar a atividade das EAO nos animais submetidos à isquemia-reperfusão renal. Evidenciamos, também, que os ratos pré-tratados ou com L-NAME ou com L-arginina demonstraram um retardo na recuperação da integridade renal após o evento isquêmico, visto que esses animais apresentaram níveis séricos de creatinina estatisticamente superiores aos do grupo isquêmico não tratado, após 192 horas de reperfusão.



     Durante a isquemia-reperfusão tecidual, as EAO, como o radical superóxido.
     (O2-), o radical hidroxil (OH-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2) podem produzir injúria celular através das reações de lipoperoxidação das membranas mitocondriais, lisossômicas e plasmáticas, alterando, então, a estrutura e a função dessas membranas (8 + 9). No rim, tais alterações são responsáveis por um aumento da permeabilidade tubular com perda das funções de transporte, bem como redução da fosforilação oxidativa mitocondrial e liberação inapropriada de enzimas líticas lisossômicas que acelerariam o processo de degradação celular, com conseqüente diminuição da função renal (1,9,10).
     A integridade da função renal depende do balanço entre fatores vasodilatadores e vasoconstritores. Na isquemia renal, o dano sofrido pelo endotélio pode desencadear um ciclo vicioso de lesão isquêmica pelo aumento da liberação de substâncias vasoconstritoras (p.ex. endotelinas) e diminuição de substâncias vasodilatadoras (p.ex. NO) (1). Além disso, alguns autores supõem que o rim seja mais sensível às diminuições das reservas de NO do que outros tecidos, visto que a infusão prévia de L-NAME é capaz de reduzir, significativamente, a natriurese, a diurese e a filtração glomerular sem, contudo, causar alteração substancial dos níveis pressóricos médios (11,12).
     Durante a fase de reoxigenação tecidual, o radical superóxido (O2-) pode reagir com o NO e formar o peroxinitrito (ONOO-), um importante radical livre que medeia, ao menos em parte, as reações de lipoperoxidação das membranas celulares no evento isquêmico-reperfusional (11). Em nossos experimentos, vimos que a inibição da produção de NO pode exacerbar e o aminoácido L-arginina pode amenizar o dano causado pelas EAO durante a isquemia-reperfusão renal em ratos. Nossos resultados concordam com achados prévios, demonstrando que precursores do NO, especialmente L-arginina, podem exercer efeitos benéficos na isquemia-reperfusão tecidual (13,14). Isso talvez demonstra que a interação entre NO e as EAO seja um tanto benéfica, ressaltando o fato de que o NO, ao reagir com O2-, na formação de ONOO-, atuaria como scavenger de O2-, impedindo, assim, a ação dessa última molécula sobre as membranas celulares, bem como a origem de outros radicais (H2O2 e OH-), causadores de injúria oxidativa (8,15). Com uma alteração do balanço na relação NO/O2-, haveria uma tendência maior na produção de PAF (fator agregante plaquetário) e LTB4 (leucotrieno B4), através de reações envolvendo os radicais O2- e H2O2, o que estimularia a adesão leucocitária, com conseqüente aumento da injúria oxidativa decorrente da isquemia-reperfusão tecidual (15).
     A produção basal de NO é necessária para a manutenção da função glomerular normal, pois a inibição da síntese de NO é responsável por aumento da resistência arteriolar eferente, aumento da pressão dos capilares glomerulares e mudanças expressivas da histologia renal (4). Tem-se demonstrado, também, que a inibição do NO exacerba a disfunção renal, ao mesmo tempo que os precursores do NO são capazes de aumentar a função renal (16). De acordo com os achados de nosso estudo, tem-se verificado que o dano funcional do rim causado pela depleção das reservas de NO é transitório; isto é, após um período de disfunção renal, o órgão é capaz de retornar à sua função normal em poucos dias (11). Tal fato pode-se dever, em grande parte, à grande reatividade e à pequena duração do tempo de meia-vida do NO (6,7).
     Bhardwaj et al. (1989) demonstraram que a L-arginina é capaz de diminuir, de modo significativo, a resistência vascular renal após evento isquêmico em rim isolado (17). Esse efeito protetor atribuído ao NO pode ser resultante de sua ação inibitória sobre o acúmulo leucocitário e da sua propriedade vasodilatadora durante a fase isquêmica (6).
     Tendo-se em vista os nossos resultados, podemos concluir que o NO tem uma função relevante durante a isquemia-reperfusão renal, pois, com a inibição da produção de NO, há uma tendência em aumentar o grau de disfunção renal, bem como exacerbar os índices de estresse oxidativo ocasionado pelas EAO medido através da técnica de QL durante o evento isquêmico-reperfusional renal em ratos. Além disso, o aminoácido L-arginina é capaz de proteger a integridade funcional e diminuir a lesão provocada pelas EAO em rins pós-isquêmicos. Resta-nos saber, agora, a real eficácia dos precursores do NO em preservar a fisiologia renal, garantindo um efeito protetor total na síndrome de isquemia-reperfusão. Para isso, é preciso a utilização de novos parâmetros de análise da função renal, tais como diurese, natriurese, Na+ excretado e depuração da creatinina endógena, bem como utilização de novas dosagens e vias de administração do L-NAME e da L-arginina e emprego de novas técnicas para mensuração da atividade das EAO e da expressão da via L-arginina/NO durante a isquemia-reperfusão renal. Todo esse esforço objetivará, em futuro próximo, o possível emprego benéfico de substâncias moduladoras da via L-arginina/NO em diferentes situações clínico-cirúrgicas, especialmente naquelas em que o rim é submetido ao processo de isquemia e reperfusão.

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Received: April 5, 2000
Accepted after revision: January 11, 2001

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