EFFECTS OF MALNUTRITION IN THE TESTIS

ELAINE C. MOTA, ALBA M. SANTOS, FABIANE P. TOSTE, FRANCISCO J.B. SAMPAIO, CRISTIANE F. RAMOS

Laboratory of Molecular Biology, Urogenital Research Unit, State University of Rio de Janeiro (UERJ), Rio de Janeiro, RJ, Brazil

ABSTRACT

     Introduction: Androgens are important to spermatogenesis in the testes, to sperm maturation in the epididymis and to development and function of male accessory glands. The goal of this study is to investigate the effect of mother’s malnutrition in the androgen receptor expression of post-weaning rat testis.
     Material and Methods: At delivery, Wistar rats were assigned to one of the following groups: control (C) = diet with 23% of protein; protein-restricted (PR) = diet with 8% of protein; energy-restricted (ER) = diet with 23% of protein in restricted quantities, according to the ingestion of PR group. At the end of lactation period, the animals were sacrificed, the testes excised, weighted and the androgen receptor determined by Western blotting technique.
     Results: Testicular weight was significantly lower (p < 0.001) in both groups at the end of lactation, when compared to controls (64.7% in the PR and 60.1% in the ER group). Both PR and ER groups had a significant (p < 0.001) increase in the relative quantity of androgen receptor, but this increment was higher in the PR group.
     Conclusion: The observed increase in the relative quantity of androgen receptor in response to the maternal malnutrition can be consequent to alterations in the serum concentrations of gonadotropins, estrogen and androgen, since the androgen receptors are regulated by these factors.

Key words: testis; malnutrition; rats; androgen receptor; Western blotting
Braz J Urol, 27: 500-506, 2001

INTRODUÇÃO

     Os hormônios androgênios são importantes para a manutenção da espermatogênese no testículo, para a maturação do espermatozóide no epidídimo e para o desenvolvimento e funções dos órgãos sexuais acessórios masculinos (1).
     Através de técnicas de imunocitoquímica, o receptor de androgênio (AR) foi localizado em tecidos do sistema reprodutor de homens e ratos de ambos os sexos (2,3). O receptor de androgênio é uma proteína com peso molecular entre 100 e 110 kd (4), já tendo sido clonada (5,6).
     Os níveis de AR são regulados por androgênio nas células de Sertoli de animais adultos (7,8), enquanto em animais imaturos o hormônio folículo estimulante (FSH) parece ser o principal regulador (9,10). Shan et al. (11) demonstraram ainda que nas células de Leydig ocorre o inverso, os níveis de AR são estimulados por androgênios nos animais imaturos, não tendo efeito nos animais adultos.
     Cardone et al. (12) utilizando cultura de células testiculares demonstraram que tanto estrogênios como androgênios podem autoregular a expressão dos RNA mensageiros dos seus próprios receptores, e ainda que os estrogênios podem diminuir a expressão dos RNA mensageiros nos receptores de androgênio. Foi demonstrado que o androgênio circulante, independente do conteúdo luminal, é responsável pela regulação da expressão dos receptores de androgênio (13).
     A restrição alimentar pode inibir tanto a manutenção como o início da capacidade reprodutiva (14,15). Camundongos adultos submetidos à restrição alimentar de 30% por até 8 semanas apresentam redução de 42% na concentração de testosterona sérica, redução de 27% na massa testicular e um aumento na apoptose, que pode ser responsável pela regressão testicular que ocorre em resposta à restrição alimentar (16).
     Não encontramos na literatura estudos sobre os efeitos da desnutrição materna no período de lactação sobre os tecidos do sistema urogenital de ratos. Assim, o presente estudo tem como objetivo investigar a expressão dos receptores de androgênio nos testículos de filhotes de ratas lactantes desnutridas.

MATERIAL E MÉTODOS

     Ratas Wistar fêmeas, nulíparas, foram mantidas em biotério com temperatura estável (25 ± 10C) e ciclo claro-escuro (7:00h - 19:00h) controlados. Foram utilizados os princípios descritos em “The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals” para os cuidados no uso e manuseio dos animais (17).
     Aos 3 meses de idade estes animais foram acasalados na proporção de 2 fêmeas para 1 macho, recebendo ração comercial (23% de proteína) até o nascimento dos filhotes, quando então foram divididas em 3 grupos de tratamento:
1)- Controle (C): com livre acesso a água e a dieta normal (ração comercial com 23% de proteína).
2)- Restrição protéica (RP): com livre acesso a água e a dieta hipoprotéica (8% de proteína).
3)- Restrição calórica (RC): com livre acesso a água, porém submetido a dieta normal (ração comercial com 23% de proteína) restrita às mesmas quantidades ingeridas no dia anterior pelo grupo em dieta hipoprotéica.
     O grupo de animais em restrição calórica, pareados pela quantidade de ração ingerida pelo grupo em dieta hipoprotéica, foi estudado a fim de diferenciar os efeitos causados pela carência exclusiva de proteína daqueles causados pela restrição calórica, uma vez que já foi demonstrado que ratas lactantes submetidas à restrição protéica ingerem uma quantidade menor de ração em relação às ratas controles (18,19).
     A dieta hipoprotéica foi preparada manualmente em nosso laboratório e sua composição é mostrada na Table. A fonte protéica (8%) desta dieta foi a ração comercial macerada (Labina - Purina Nutrimentos Ltda.) e as calorias foram compensadas pelo acréscimo de amido de milho a fim de se obter uma dieta hipoprotéica e isocalórica. As vitaminas e os minerais foram suplementados de maneira a se obter a mesma composição da ração comercial que é baseada nas recomendações do National Research Council e do National Institute of Health, USA (20).



     A dieta hipoprotéica foi administrada a partir do dia do nascimento dos filhotes quando a ninhada foi ajustada em número de 6. Este número de filhotes foi escolhido porque segundo Fishbeck & Rasmussen parece ser este o número de animais que confere o maior potencial lactotrófico (21). Provavelmente, o tamanho da ninhada influencia muito mais na quantidade de leite produzida do que em sua composição (22).
     Aos 21 dias de lactação os animais foram anestesiados com tiopental (0.1 ml/100g peso corporal), os testículos foram excisados, pesados e armazenados a –700C para posterior determinação dos receptores de androgênio pela técnica de Western blotting.
     Os testículos foram homogeneizados em tampão de homogeneização (50mM TRIS pH 7.4, 1.5mM EDTA, 50mM NaCl, glicerol 10%, 5mM DTT, 10mg/ml de leupeptina e 30ml/g tecido de PMSF) em um volume de 250ml. O homogenato foi então centrifugado a 100.000 Xg, por 2h, a 40C. O sobrenadante foi coletado e armazenado a –200C. A quantidade de proteína total do sobrenadante foi determinada utilizando-se o método de Bradford (23).
     As proteínas foram separadas em gel de acrilamida 8% (SDS-PAGE). Foram adicionados cerca de 60 mg de proteína das amostras em cada slot do gel. Logo após, as amostras foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, a qual foi bloqueada com tampão towbin (31mM TRIS pH 7.4, 3.4 mM KCl, 0.17M NaCl, 0.05mM vermelho de fenol, 0.1% tween 20) contendo 5% de leite desnatado, por 1h, com agitação. Posteriormente a membrana foi incubada com anticorpo específico (rabbit polyclonal 200 mg/ml, Santa Cruz proced) em tampão towbin contendo 0.25% de leite desnatado “overnight”, com agitação, lavada 3 vezes com tampão towbin, seguindo-se então uma incubação adicional com o segundo anticorpo (peroxidase-conjugated donkey IgG, 1:2000), por 1h, com agitação. Após lavagem da membrana 3 vezes com tampão towbin, a membrana foi incubada com reagente de detecção ECL (Amersham) por 5 minutos e exposta num hiperfilme ECL para autoradiografia (Amersham). A densitometria foi feita utilizando o programa de computador Scion Image.
     As diferenças entre os grupos foram determinadas através de análise de variância univariada associada a teste de comparação múltipla entre as médias, teste de Newman-Keuls (24).

RESULTADOS

     O peso do testículo dos filhotes de ratas submetidas a restrição protéica ou calórica na lactação apresentou redução significativa (p < 0.001) e está representado na Figure-1. A redução observada no peso do testículo do grupo Restrição Protéica (RP) é de 64.7% e do Restrição Calórica (RC) é de 60.1%.



     A concentração de proteína nos testículos dos filhotes de ratas lactantes desnutridas diminuiu significativamente(Figure-2), porém quando analisamos por grama de tecido esta diferença desaparece.



     Os animais cujas mães foram submetidas a ambos os tipos de desnutrição apresentaram uma quantidade de receptor significativamente maior que os animais controle, sendo que o aumento no grupo RP foi significativamente maior que no RC (Figure-3).



DISCUSSÃO

     A desnutrição materna na lactação levou a uma redução significativa no peso do testículo, o que está de acordo com Young et al. (16) que relatou diminuição de 27% no testículo de camundongos adultos desnutridos.
     Acreditamos que a concentração de proteínas totais no testículo foi reduzida pela desnutrição materna em decorrência da redução no peso do testículo, já que quando relacionamos a concentração protéica por grama de tecido esta alteração não foi mais observada.
     A expressão de receptores de androgênio (AR) nos vários tecidos ou células varia em resposta ao androgênio. Os níveis de RNA mensageiro dos AR, em resposta ao androgênio, aumentam no rim de aves (25) e no músculo liso do pênis de rato (26), enquanto diminuem no fígado de aves (25) e na próstata ventral de ratos (7). Ao nível protéico, os AR parecem diminuir na próstata e vesículas seminais de rato em resposta ao androgênio.
     Zhu et al. (8) demonstraram que os AR são regulados pelo androgênio circulante, de maneira diferente nas células de Sertoli, de Leydig e no epidídimo de ratos adultos. Além disto, alguns autores sugerem que o FSH e não o androgênio seja o regulador principal da expressão dos AR em testículos de animais imaturos (9,10).
     Cardone et al. (12) utilizando cultura de células testiculares demonstraram ainda que o estrogênio pode diminuir a expressão dos RNA mensageiros dos receptores de androgênio.
     Em macacos adultos, foi demonstrado por Console et al. (28) que a desnutrição protéica leva a mudanças morfométricas e ultra-estruturais nos gonadotrofos, com diminuição na densidade volumétrica e celular e sinais compensatórios de hiperfunção.
     Com base nesses relatos podemos sugerir que a desnutrição materna pode acarretar alterações nas concentrações séricas de gonadotrofinas lipofisárias (LH, FSH), androgênios ou estrogênios na prole, justificando o aumento encontrado nos receptores. Outros estudos, com dosagem das concentrações séricas de LH, FSH, androgênios e estrogênios, junto com a determinação dos AR no testículo estão sendo conduzidos para confirmar estes achados.

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Pesquisa financiada pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) Brazil.

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Received: August 16, 2001
Accepted after revision: October 6, 2001

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