PROGNOSTIC
SIGNIFICANCE OF P53 GENE EXPRESSION IN
TRANSITIONAL CELL CARCINOMA OF THE BLADDER
SÍLVIO HENRIQUE
MAIA DE ALMEIDA, DANIELA DERROSSI, MARCO AURÉLIO FREITAS RODRIGUES,
MARCOS LIBONI, RENATA DINARDI BORGES,
HORÁCIO ALVARENGA MOREIRA
Department of Surgery, Section of Urology and Section of Applied Pathology, State University of Londrina, Paraná, Brazil
ABSTRACT
Purpose:
There is evidence that the p53 gene expression has prognostic value in
patients with bladder transitional cell carcinoma (TCC). We evaluated
the p53 expression, by means of immunohistochemistry, as a prognostic
factor in the TCC of the bladder in our Institution and compared our findings
with those reported in the literature.
Material and Methods: A retrospective study
of 80 patients with bladder TCC (65 male and 15 female) aged 18 to 81
years old (mean = 62) was performed. Mean follow-up time was 33 months.
Representative tumor sections were stained with an anti-p53 antibody.
Chi-square and Fisher’s exact test were used, and survival curves
were plotted and analyzed using the Kaplan-Meier method. A value of p
< 0.05 was considered statistically significant.
Results: Of the 80 patients studied, 41
were at stage Ta/T1 (51.2%) and 39 at stage T2/T4 (48.8%). Fifty-two (65%)
had histological grade 2 or less and 28 (35%) had grade 3 or 4. Tumors
with less differentiated histological grades correlated with recurrence
(p = 0.001), progression and tumor-related death (p = 0.005). Increased
expression of p53 was observed in 38 cases (47.5%) and was associated
with higher grades and advanced stages, but not with recurrence, progression
or tumor-related death (p = 0.01 and p = 0.045, respectively). Histological
grade was the most significant factor for recurrence. Patient survival
after diagnosis was lower for the group with histological grade greater
than 2 (p = 0.015). Histological grade greater than 2 and advanced stages
were also related with earlier recurrence.
Conclusion: The results confirm the importance
of histological grade as a prognostic factor. The immunohistochemical
expression of p53 was not found to be a prognostic marker, possibly due
to tumor-related variations and method limitations. Nevertheless, the
results suggest that the evaluation of p53 may bring additional information
to the traditional prognostic factors currently in use.
Key words:
bladder, bladder neoplasms, transitional cell, p53 protein, genes, prognosis
Braz J Urol, 26: 378-384, 2000
INTRODUÇÃO
Em
1991 descreveu-se a associação das mutações
do gene p53 com casos de carcinoma do epitélio transicional da
bexiga (CET) de alto Grau histológico e invasivos, e sugeriu-se
um possível valor clínico para a detecção
da proteína p53 através da técnica de imuno-histoquímica
(1).
Sarkis et al. testaram a reação
imuno-histoquímica da proteína p53 em 43 carcinomas vesicais
estádio T1 (2). Detectaram que pacientes com aumento de expressão
da proteína p53, ou seja, aqueles portadores de tumores com mutação
do gene p53, têm alta probabilidade de progressão. Porém,
reafirmaram a necessidade de novos estudos para confirmar os resultados
e justificar o uso do método clinicamente. Existem dados na literatura
conflitantes a esses, e persiste a dúvida quanto ao papel da expressão
da gene p53 como fator independente no prognóstico de carcinomas
vesicais (3-6).
Diante das contradições da
literatura elaborou-se um estudo para comparar a expressão imuno-histoquímica
da proteína p53 com os tradicionais fatores prognósticos
do carcinoma do epitélio transicional vesical (CET): Grau histológico
e estádio clínico. Pretendeu-se ainda, analisar as possíveis
diferenças entre os resultados da literatura sobre o tema.
MATERIAL E MÉTODOS
A
população consistiu de 80 pacientes tratados entre 1986
e 1997, sendo 15 (18.8%) mulheres e 65 (81.3%) homens, acompanhados em
média por 33 meses, com variação de 2 a 144 meses.
A idade variou entre 18 anos e 81 anos, com média de 62 anos.
As variáveis estudadas foram estádio
clínico, Grau histológico e expressão imuno-histoquímica
da proteína p53 no momento do diagnóstico.
Sem conhecimento do diagnóstico prévio,
estádio e da evolução do doente um patologista revisou
todas as lâminas das peças cirúrgicas, em busca da
amostra mais significativa de cada tumor, dividindo-se a graduação
histológica em 2 grupos: grupo A com tumores de Grau I e II e grupo
B com tumores acima de Grau II (classificação da OMS).
A análise imuno-histoquímica
foi realizada com tecidos deparafinados da lâmina com o padrão
celular mais representativo de cada paciente, e processados com o anticorpo
anti-p53 PAb 1801 (anticorpo murino, classe IgG1, Vector Labs, Burlingame,
CA). Usou-se como controles positivos da técnica fragmentos de
carcinoma de mama com p53 positivos, e epitélio normal, linfócitos
e células estromais como controles negativos intra-teciduais.
Considerou-se como positivo para a expressão
da proteína p53 tumores com pelo menos 10% das células reagentes,
conforme protocolo anterior na literatura (7).
Os resultados foram ordenados em 2 grupos:
carcinomas positivos e negativos para a proteína p53.
A classificação do estádio
clínico dividiu a população em outros 2 grupos: tumores
superficiais (até T1) e tumores infiltrativos ou metastáticos
(acima de T1).
As análises das variáveis
foram verificadas pelo Teste do Qui-quadrado e Teste Exato de Fisher.
As curvas para o tempo livre da doença foram obtidas através
da técnica de Kaplan-Meier e comparadas pelos testes de Cox-Mantel
e Wilcoxon. Adotou-se o nível de significância de 5%.
RESULTADOS
Quarenta
e um pacientes classificaram-se no grupo de estádio Ta/T1 (51.2%)
e 39 pertenceram ao grupo T2 a T4 (48.8%), sendo ambos os grupos uniformes
para a idade e sexo. Cinqüenta e dois pacientes (65%) incorporaram-se
ao grupo A de Grau menor ou igual a II e 28 (35%) entre aqueles de Grau
histológico maior que II (grupo B).
Quarenta e três pacientes apresentaram
recorrências tumorais (53.7%) e desses, 13 progrediram e evoluíram
para o óbito (16.3%). Não existiram diferenças entre
os grupos com e sem recorrências em relação à
idade e tempo de acompanhamento. Casos com Graus histológicos maior
que II apresentaram uma maior probabilidade de recidiva e de progressão
com óbito, com p = 0.001 e p = 0.005 respectivamente.
A expressão aumentada da proteína
p53 foi observada em 38 casos (47.5%). Essa porcentagem não se
alterou mesmo quando elevou-se o índice de positividade nuclear
para 20%.
Houve
uma associação entre tumores Grau III (grupo B) e p53 positivo
(p = 0.001), e também, entre tumores com estádio T2 a T4
e p53 positivos (p = 0.045). Não existiu associação
entre casos p53 positivos e recorrência tumoral (p = 0.24) ou com
os casos que progrediram ao óbito (p = 0.086). A distribuição
das variáveis quanto à incidência de recorrências
e óbitos está ilustrada na Tabela-1.
O grupo com Grau histológico maior
que II apresentou um menor tempo de sobrevida após o diagnóstico
(p = 0.015). A curva de sobrevida em relação ao Grau histológico
está representada na Figura-1. A expressão do gene p53 não
se relacionou com menor tempo de sobrevida (p = 0.273).
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O Grau histológico maior que II também constituiu-se em fator significativo para a distribuição da recorrência ao longo do tempo (p = 0.002) com tendência a recorrências antes dos 2 anos de acompanhamento (Figura-2). O mesmo existiu para estádios avançados (p = 0.001) (Figura-3).
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Apenas 2 tumores com p53 positivo recorreram após 2 anos de acompanhamento, em contraste aos tumores p53 negativos com distribuição de recorrências mais uniforme ao longo do tempo (p = 0.013). A Figura-4 sumariza as recorrências ao longo do tempo de acordo com a expressão do gene p53.
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DISCUSSÃO
Não
existem pesquisas prospectivas sobre o gene p53 no carcinoma do epitélio
transicional vesical, existindo assim, a possibilidade de erros metodológicos
inerentes aos diversos estudos retrospectivos.
Uma possível explicação
para os resultados conflitantes da literatura a respeito da função
do gene p53 no CET é a dificuldade de padronização
das diferentes técnicas de detecção das mutações
do gene p53, já que nenhuma delas têm sensibilidade de 100%
(3). Por exemplo, existe uma relação inversa entre o tamanho
do fragmento de DNA e a sensibilidade da reação em cadeia
da enzima polimerase. Em um fragmento com 155 pares de bases a sensibilidade
é de 97%, para um fragmento de 420 pares é de 58% e apenas
3% para 600 pares (8).
A proteína p53 mutada tem uma meia-vida
maior que a proteína natural, permitindo sua identificação
através da reação com anticorpos específicos.
Assim na técnica de imuno-histoquímica, resultados falsos
positivos podem ocorrer sem a mutação do gene p53, pelo
aumento da transcrição em células rapidamente proliferativas
ou pela inativação de um fator necessário para a
degradação da proteína p53, desencadeando uma quantidade
relativa maior da proteína p53 natural. E, embora considere-se
que 90% das mutações possam ser detectadas por imuno-histoquímica,
falsos negativos ocorrem em mutações que produzem proteínas
p53 muito alteradas, que não respondem aos receptores nucleares
(8).
Outra explicação às
controvérsias seria a diferente expressão dos vários
anticorpos, que comparados ao PAb 1801, apresentam resultados inferiores
na detecção das mutações em tecidos fixados
em formalina. Por outro lado, o grau de concordância entre a imuno-histoquímica
com o anticorpo Pab1801 em material a fresco e parafinado está
torno de 92% a 96% (9). Contudo, comparando-se 3 anticorpos: CM1, PAb1801
e D07, em exames a fresco (10 casos) e em parafina (21 casos), observou-se
que o principal fator de discordância é a expressão
variável da proteína p53 dentro de uma mesma amostra tumoral,
independente do anticorpo utilizado (10).
Considerou-se o índice de 10% de
positividade nuclear como ponto de corte para a expressão do gene
p53, porém não existiram mudanças na porcentagem
de casos positivos quando aumentou-se esse índice para 20%. A literatura
contém estudos com índices de corte de 5% a 40%, porém
a maioria dos autores adota 10% ou 20% (11-13). Assim, sugere-se que o
índice adotado como critério de positividade não
deva influir como causa para os diferentes resultados da literatura.
Além das questões técnicas
ou metodológicas, existem também dúvidas sobre a
biologia tumoral. Uma origem policlonal para o CET pode explicar a expressão
imuno-histoquímica heterogênea dentro de um mesmo tumor,
limitando assim a utilidade do método. Outra hipótese é
a própria ação do gene p53 que se efetua por fatores
apenas parcialmente por ele controlado. Por exemplo, a proteína
p53 normal ativa complexos ciclina-dependentes bloqueando o ciclo celular
em G1, porém, existem mecanismos que também bloqueiam a
fase G1, mesmo na presença da proteína p53 mutada. A expressão
imuno-histoquímica tumoral provavelmente reflete apenas uma parte
da complexa interação entre genes e fatores de ativação
(14). O estudo dessa “cascata” molecular poderia explicar melhor
a discordância da literatura (3-6).
A expressão aumentada do gene p53
não foi fator prognóstico, mas alguns aspectos observados
sugerem uma participação dessa variável na evolução
da neoplasia. A mutação do gene p53 relacionou-se com alto
Grau histológico e estádio avançado. Do mesmo modo,
as recidivas de casos p53 (+) foram mais precoces.
Pode-se contrapor a esses resultados, a
idéia de que eles apenas refletem os já demonstrados pelo
Grau histológico. Mas não se deve esquecer, de que a definição
do Grau depende da interpretação pessoal do patologista
sobre as diversas características morfológicas celulares,
e que nem sempre laudos de diferentes patologistas são concordantes.
Uma alternativa seria estudar a concomitância
da mutação do gene p53 com outros genes e fatores celulares,
procurando assim outras interações no ciclo celular. Porém,
também essas correlações demonstram resultados duvidosos
quanto ao seu valor clínico (5,15).
Sabe-se que geralmente recorrências
superficiais ocorrem com tumores diplóides e p53 mutante negativo
e, tumores com metástases são aneuplóides e p53 positivos,
porém, ambos sem vantagens prognósticas sobre os índices
de proliferação celular (15). Outros autores estudaram a
associação de ambos fatores e ainda que com casuísticas
pequenas, 33 e 87 casos, respectivamente, sugeriram vantagens na detecção
prognóstica da associação entre aneuploidia e expressão
aumentada da proteína p53 (5,16).
Um segundo efeito cooperativo estudado foi
do gene p53 e gene do retinoblastoma (Rb). A concomitância da perda
do gene Rb e a expressão aumentada do gene p53 foi relacionada
com o aumento da fração de crescimento celular em CET (9).
A progressão foi rápida e a sobrevida diminuiu sobremaneira
quando houve a associação da alteração do
p53 e pRb em 59 pacientes estudados por Cordon-Cardo; resultado não
repetido em outras séries (14,17).
Um único trabalho obteve com a combinação
em duplas ou triplas de genes alterados (p53, MIB-1, C-erb B2, fator de
crescimento epitelial e bcl-1) resultados superiores aos do Grau histológico
(18). Outras correlações foram estudadas, mas sua utilização
em clínica como fatores prognósticos ainda aguarda estudos
randomizados, prospectivos e com amostra suficiente de pacientes. Além
disto o custo elevado justifica seu uso somente em pesquisas (19,20).
CONCLUSÃO
A
expressão aumentada do gene p53 relacionou-se com alto Grau histológico,
estádio avançado e um tempo precoce para recorrências,
mas não se relacionou com óbitos ou recorrências.
Os resultados encontrados neste trabalho
reafirmam a importância dos fatores prognósticos tradicionais,
principalmente o Grau histológico, único fator prognóstico
relacionado simultaneamente com recorrência, progressão e
óbitos.
A expressão imuno-histoquímica
do gene p53 não alterou a importância desses fatores; e sua
positividade na condução dos casos de carcinomas do epitélio
transicional veio somar informações ao diagnóstico.
Necessita-se compreender melhor a relação
entre os vários agentes atuantes na biologia tumoral, aprimorar
e padronizar técnicas de detecção para uma conclusão
definitiva sobre o papel clínico da expressão do gene p53.
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Received: February 23, 2000
Accepted after revision: July 19, 2000
COMENTÁRIO EDITORIAL
Com
o avanço da biologia molecular, vários cromossomos, genes
e proteínas vêm sendo pesquisados e alguns como o p53, PCNA,
Ki67, BCL-2, c-ERB e outros vem tendo importância no prognóstico
e seguimento de vários tumores urológicos.
A literatura é controversa ainda
em vários pontos, com trabalhos mostrando importância na
expressão do p53 quanto ao prognóstico dos tumores uroteliais
vesicais superficiais, e outros não conseguindo mostrar essa diferença.
Na discussão o autor abordou com propriedade que a heterogenicidade
das séries e dos métodos podem ser responsáveis pelos
diferentes resultados. O fato da maioria das séries apresentarem
casuísticas retrospectivas e com material colhido da parafina também
são fatores que podem contribuir para resultados controversos.
Múltiplas anormalidades moleculares
têm sido identificadas no carcinoma urotelial de bexiga, entre eles
a perda de material genético do cromossomo 9, provocando a inativação
de gens supressores de tumor. As alterações do cromossomo
9 parecem ser secundárias nessas lesões, sendo que a inativação
do p53 geralmente ocorre antes da perda do cromossomo 9.
Certamente os passos da tumorogênese
da bexiga são vários e alguns desconhecidos, porém
com o avanço da genética molecular, importantes aspectos
da gênese, diagnóstico, tratamento e seguimento desses tumores
serão entendidos e poderão ser utilizados na prática
clínica.
Flávio
Hering
Escola Paulista de Medicina (UNIFESP)
RESUMO
IMPORTÂNCIA PROGNÓSTICA DA EXPRESSÃO DO GENE P53 NO CARCINOMA DE CÉLULAS TRANSICIONAIS DA BEXIGA
Objetivo:
Verificar a importância prognóstica do gene p53 através
de imuno-histoquímica no carcinoma do epitélio transicional,
comparando-o com Grau histológico e estádio clínico.
Métodos: Estudo retrospectivo com
80 pacientes acompanhados por 33 meses em média. Empregou-se o
anticorpo PAb 1801 em peças deparafinadas. Utilizou-se o teste
do Qui-quadrado e o Teste Exato de Fisher; as curvas de sobrevida foram
analisadas com a técnica de Kaplan-Meier, com p < 0.05.
Resultados: Quarenta e um pacientes classificaram-se
como estádio Ta/T1 (51.2%) e 39 como T2/T4 (48.8%); 52 deles (65%)
apresentaram Grau histológico menor ou igual a II e 28 pacientes
(35%) Grau maior que II. Tumores com Graus histológicos indiferenciados
relacionaram-se com recorrências (p = 0.001), progressão
e óbitos (p = 0.008), e estádios avançados com progressão
e óbitos (p = 0.005). A expressão aumentada da proteína
p53 esteve presente em 38 casos (47.5%) e associou-se à altos Graus
e estádios avançados (p = 0.001 e p = 0.045), mas não
com recorrência ou progressão e óbito (p = 0.24 e
p = 0.086). Ao longo do tempo a expressão aumentada do p53 apresentou
uma tendência de recorrência mais precoce do que no grupo
p53 negativo (p = 0.013). O grupo com Grau histológico maior que
II mostrou uma sobrevida mais curta (p = 0.015). O Grau histológico
maior que II e estádios avançados também constituíram-se
em fatores significativos para a precocidade da recorrência (p =
0.002 e p = 0.001).
Conclusão: Nossos resultados reafirmam
a importância do Grau histológico como fator prognóstico.
A expressão imuno-histoquímica do gene p53 não representou
um marcador prognóstico, provavelmente por fatores inerentes ao
tumor e também pelas limitações do método.
Entretanto, os resultados sugerem que ela possa somar novas informações
aos fatores prognósticos tradicionais.
Unitermos:
bexiga, carcinoma de bexiga, células transacionais, p53, prognóstico
Braz J Urol, 26: 378-384, 2000
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Correspondence address:
Sílvio Henrique Maia de Almeida
Rua Paes Leme, 1081/301
Jardim Ipiranga, Londrina, PR, 86010-520
Fax: ++ (55) (43) 337-1800